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科學(xué)家研發(fā)新型核酸檢測系統,單次材料成本低至約0.02美元(新冠核酸檢測的成本)

近日,上海交通大學(xué)王鵬飛教授和團隊,設計一種無(wú)需預擴增的新型 DNAzyme 傳感器,并將其并命名為 SPOT。

科學(xué)家研發(fā)新型核酸檢測系統,單次材料成本低至約0.02美元(新冠核酸檢測的成本)

圖 | 王鵬飛(來(lái)源:王鵬飛)

對于以 miRNA 和病毒 RNA 為代表的多種臨床意義核酸標記物,本次傳感器均具備檢測能力,并能實(shí)現快速、便捷的臨床分子診斷應用。

通過(guò)針對血清 miRNA 進(jìn)行敏感和特異的檢測,進(jìn)而可以用于乳腺癌、胃癌前列腺癌等多種癌癥的分子診斷。

此外,SPOT 能從臨床拭子中靈敏準確地檢測 SARS-CoV-2 RNA。同時(shí),SPOT 可以與側流層析技術(shù)聯(lián)合,實(shí)現對于核酸靶標的即時(shí)(POCT,point-of-care testing)檢測。

科學(xué)家研發(fā)新型核酸檢測系統,單次材料成本低至約0.02美元(新冠核酸檢測的成本)

(來(lái)源:Angewandte Chemie International Edition)

鑒于 SPOT 完全由合成 DNA 分子構建,避免了對于昂貴蛋白質(zhì)酶的需求,具備較好的成本優(yōu)勢。

實(shí)驗顯示,一次 SPOT 測定的材料成本,大約低至 0.02 美元,明顯低于已有的檢測體系。

與現有基于 DNA 酶、或基于 CRISPR 的核酸靶標測定相比,這種靈敏且特異的分析性能、一步法的操作方案、低成本的優(yōu)勢、以及和 POCT 能力的結合,讓 SPOT 能夠成為一種更好的測定方法。

未來(lái)在檢驗醫學(xué)領(lǐng)域,該團隊希望利用 SPOT 體系針對循環(huán)體內核酸進(jìn)行檢測,實(shí)現多類(lèi)型疾病的靈敏特異分子診斷,從而為疾病的早期診斷和精準治療提供新的可能。

進(jìn)一步地,他們也希望基于核酸適體的結合,能夠進(jìn)行小分子與蛋白的檢測,擴展 SPOT 系統在多方面的臨床診斷應用。

此前,在體內遞送治療方面,傳統的 DNAzyme 不具備可編程的靶向性。而該團隊設計的新型 DNAzyme 體系可以快速設計和實(shí)現可編程的靶向目標鏈,并通過(guò)切割來(lái)達到治療目標。

總的來(lái)說(shuō),這一創(chuàng )新有望為疾病治療提供更精準、更有效的手段,為基因治療和精準醫學(xué)的發(fā)展帶來(lái)重要推動(dòng)。

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(來(lái)源:Angewandte Chemie International Edition)

那么,本次成果的研發(fā)必要性是什么?它彌補了已有測量工具的哪些不足?

據介紹,生物體液(血液、尿液、汗液等)中存在的核酸分子,是對包括癌癥和病毒感染等重大疾病進(jìn)行分子診斷的一類(lèi)關(guān)鍵生物標志物。

然而,核酸標志物存在低豐度、高度動(dòng)態(tài)、高異質(zhì)性、背景干擾大等特點(diǎn),其臨床檢測面臨著(zhù)測不出、測不準、測不全、測不了、測不起等挑戰。

因此,迫切需要開(kāi)發(fā)超靈敏、高特異、通量高、便捷經(jīng)濟的核酸生物標志物檢測分析方法。

DNAzymes 是一類(lèi)體外篩選的合成 DNA 分子,具有類(lèi)似酶的催化活性,例如裂解核酸磷酸二酯鍵。

典型的裂解核酸 DNAzyme,由具有催化能力的催化核心、以及用于通過(guò)序列互補性識別底物的兩條臂組成。

因此,當前許多 DNAzyme 已經(jīng)廣泛用于體外和體內的金屬離子檢測,因為它們的催化活性高度依賴(lài)于金屬離子。

然而,具有小分子、蛋白質(zhì)或核酸檢測能力的 DNAzyme 鮮有報道,導致這些目標很難被檢測到。

受自然酶和核酸酶的啟發(fā),通過(guò)實(shí)施異構模塊(如 aptamer、toehold)來(lái)設計異構的 DNAzyme 生物傳感器,可以通過(guò)小分子、蛋白質(zhì)、核酸或細菌等,調節因子介導其催化活性。

傳統的異構 DNAzyme 生物傳感器通常被設計成多組分分子復合體,通過(guò)具有 toehold 的抑制鏈,來(lái)抑制并釋放 DNAzyme。

以及通過(guò)在靶結合后分裂并恢復催化核心,或通過(guò)靶誘導的 DNAzyme-底物-靶標復合物的穩定,來(lái)實(shí)現對于核酸靶的直接檢測。

然而,這些生物傳感系統對于定向核酸的直接檢測,通常表現出皮摩爾至納摩爾的敏感性,因此無(wú)法探測臨床樣本中的 miRNA 或病毒 RNA 標志物。

而許多 miRNA 被視為是多種癌癥的潛在生物標志物,然而由于缺乏癌癥診斷的敏感性和特異性,很少有 miRNA 被證明在臨床上有用。

王鵬飛認為,這種多組分設計可能會(huì )對其檢測能力產(chǎn)生負面影響。

由于一些原因比如化學(xué)計量的不完善、動(dòng)力學(xué)分子陷阱、催化活性受損、以及信號泄漏的風(fēng)險增加,會(huì )導致低豐度目標更加難以被測量。

而該課題組的主要研究興趣是:開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、快捷、靈敏的新型疾病分子診斷方法。

通過(guò)調研,該團隊發(fā)現體液中的循環(huán)核酸已經(jīng)成為多種疾病的重要液體活檢生物標志物。

由于這些核酸生物標志物在生物標本中的高度動(dòng)態(tài)、異質(zhì)性和低豐度,導致其臨床檢測面臨著(zhù)巨大挑戰。

傳統的聚合酶鏈式反應(PCR,Polymerase Chain Reaction)技術(shù)需要嚴格的樣品處理、昂貴儀器和專(zhuān)業(yè)操作。

而新型等溫擴增方法,比如重組酶聚合酶擴增(RPA,Recombinase Polymerase Amplification)、環(huán)介導等溫擴增(LAMP,Loop-mediated isothermal amplification)等則能簡(jiǎn)化操作過(guò)程。

而盡管 CRISPR 結合等溫擴增技術(shù),能夠顯示出較高的靈敏度和便捷性,但是存在非特異性擴增、連續操作步驟和對昂貴易損酶的需求等缺陷,限制了臨床上的應用。

通過(guò)對以上這些因素的思考、并結合課題組自身優(yōu)勢,他們定下了本次課題。

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(來(lái)源:Angewandte Chemie International Edition)

通過(guò)理論模擬與設計,他們設計出了這種新型 DNAzyme 傳感器 SPOT。為了明確 SPOT 的機制并優(yōu)化實(shí)驗參數,課題組研究了具體的激活方式、以及可應用的核酸靶標長(cháng)度。

由于 DNAzyme 傳感器的自身特性,最初他們設計的 DNAzyme 傳感器信號泄漏非常嚴重,無(wú)論如何優(yōu)化實(shí)驗條件,都無(wú)法達到穩定、高靈敏的檢測目的。

通過(guò)大量的文獻調研,以及學(xué)習和理解此前 DNAzyme 傳感器的設計原理,再結合組內討論他們認為:自封鎖核酸鏈的設計,或許可以解決信號泄漏的問(wèn)題。

后來(lái),通過(guò)一系列的實(shí)驗,信號泄漏問(wèn)題已經(jīng)被解決。但是,DNA 酶傳感器卻無(wú)法被激活。

于是,他們進(jìn)一步優(yōu)化參數,通過(guò)縮短結合臂的長(cháng)度,最后成功構建了 DNAzyme 傳感器。

通過(guò)此,他們構造了一個(gè)單鏈、自鎖定的單分子系統,并將這種傳感系統命名為 SPOT(用于核酸檢測的靈敏的環(huán)啟動(dòng) DNAzyme 生物傳感器)。

同時(shí),他們進(jìn)一步將 SPOT 與試紙條結合,為 SPOT 實(shí)現 POCT 檢測奠定了基礎。

經(jīng)過(guò)全面優(yōu)化和 SPOT 檢測,在單管、一步、無(wú)預擴增和等溫檢測的前提下,實(shí)現了對 miR-21 的 15fM、對病毒 RNA 的 1.9aM 的強大檢測靈敏度,以及對于核酸靶標的檢測特異性(區分變異體)。

最終,相關(guān)論文以《一種用于核酸敏感檢測的可編程 DNAzyme》(A Programmable DNAzyme for the Sensitive Detection of Nucleic Acids)為題發(fā)在 Angewandte Chemie International Edition[1]。

史辰致是第一作者,王鵬飛擔任通訊作者。

科學(xué)家研發(fā)新型核酸檢測系統,單次材料成本低至約0.02美元(新冠核酸檢測的成本)

圖 | 相關(guān)論文(來(lái)源:Angewandte Chemie International Edition)

不過(guò),目前只有少量臨床樣本在 SPOT 上進(jìn)行測試。未來(lái),課題組將對更多患者進(jìn)行臨床研究,以便全面評估 SPOT 測定的可靠性。

同時(shí),由于本次研究采用了無(wú)前置放大器的方案,因此 SPOT 還不夠靈敏,無(wú)法在肉眼可見(jiàn)的測試條上,產(chǎn)生明顯可區分的讀數。

因此,該團隊打算進(jìn)一步提高 SPOT 的靈敏度,或與基于等離子體/熒光的便攜式可視化設備結合,以便讓 SPOT 的 POCT 能力能被用于實(shí)際應用。

未來(lái),在臨床應用層面,他們希望能夠建立多中心、大規模臨床隊列,對 SPOT 體系的疾病診斷效能進(jìn)行更大范圍的論證。

在技術(shù)改進(jìn)層面,該團隊計劃拓展 SPOT 的應用范圍。除了核酸檢測外,他們也希望通過(guò)引入核酸適體,來(lái)實(shí)現對于小分子和蛋白標志物的檢測。

參考資料:

1.Shi, C., Yang, D., Ma, X., Pan, L., Shao, Y., Arya, G., … & Wang, P. (2024). A Programmable DNAzyme for the Sensitive Detection of Nucleic Acids. Angewandte Chemie International Edition, e202320179.

運營(yíng)/排版:何晨龍

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